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PCR仪反应体系异常状况分析

点击次数:131 发布时间:2021-12-21
   PCR仪扩增可设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)。因为被扩增的不同的DNA段其适合的退火温度不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样既节约时间,也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。正真的梯度,是每一排管都有准确的加热控温探头。其他的都是从两头的热传递来设计控温,它多应用于科研、教学机构。
  PCR仪的反应体系出现异常状况时的分析:
  一、非特异性扩增产物的出现
  当扩增产物不止一种时,通常与以下几种情况有关:
  1.背景DNA与引物同源性高,可通过在两个引物的内侧序列上再使用另一对扩增产物DNA再次进行PCR扩增;
  2.退火温度太低,引物和模板的配对是一个动态过程,分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到佳配对位点上,退火温度太低,造成引物与模板的非特异性位点部分配对而解离不下来,这种不正确的配对,进入PCR反应过程就可扩增出非特异性的产物DNA,提高退火的温度将可改善结果;
  3.过量的酶,Mg2+,引物和模板DNA可使PCR反应造成混乱,强行扩增出非特异性产物DNA,适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。
  二、无特异性扩增产物带
  1.引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类,造成引物降解;
  2.模板DNA制备时模板已降解;
  3.Taq酶有失活或有杂酶污染;
  4.缓冲液条件不当;
  5.引物不正确。
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