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质量光度计表征蛋白质相互作用的平衡态

点击次数:102 发布时间:2022-08-24

应用案例(质量光度计-MP):质量光度计表征蛋白质相互作用的平衡态

Characterization of protein interaction equilibria

翻译整理:北京佰司特贸易有限责任公司     

质量光度计定量了溶液中生物分子的质量分布。蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质复合物形成通常是涉及多个成分的多步骤反应。质量光度计是一种新的分子光谱分析方法,它可以监测复杂的平衡反应的形成,并评估化学环境或蛋白质浓度的变化如何影响平衡。质量光度计以单分子方式直接测量样品中所有蛋白质群体的相对浓度。

DNA复制到细胞周期控制,蛋白质-蛋白质相互作用对几乎每一个细胞过程都至关重要。由于蛋白质之间的相互作用主要是非共价的,它们通常以平衡状态存在。评估系统在扰动后如何恢复平衡,可以深入了解反应动力学,而相互作用亲和力是通过测量平衡时每个组分的相对浓度来确定的。然而,当感兴趣的系统包括低浓度下的多个反应或组分时,蛋白质-蛋白质相互作用的研究可能变得复杂。在这些条件下,体积或平均测量值迅速下降。相比之下,质量光度计是一种单分子分析技术,因此它可以直接测量样本中所有组分的分子质量和相对丰度。在这里,我们使用质量光度计研究形成四聚体的重组蛋白的低聚过程。

表征反应平衡的形成

蛋白质-蛋白质相互作用系统受到干扰后,如总蛋白质浓度的变化,系统会重新平衡。此处研究的重组蛋白主要在高浓度(>100μM)下形成四聚体,但我们研究了其在低nM浓度范围内的行为,这在生理上更为相关。将样品稀释至10 nM后,通过光度测定法检测到分子量与单体、二聚体和四聚体形式相对应的物种种群(图1)。其他组分,如三聚体、五聚体和八聚体,也可见,但丰度较低。随着时间的推移,四聚体的比例减少,而单体的比例增加,直到在大约一小时的培养后达到质量平衡。二聚体的比例随时间大致保持不变。为了生理相关性,样品在37°C下培养;质量光度计测量在室温下进行。在这里,质量光度计提供了一种快速简便的方法来评估所需的孵育时间,以确保随后的实验在平衡状态下进行。

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量化蛋白质浓度如何影响平衡状态

一旦低聚体系达到平衡状态,每种蛋白质的相对浓度将随着总蛋白质浓度的变化而变化。通常,总浓度的增加将有利于形成高阶蛋白质复合物,而减少将有利于单体或低阶低聚物。质量光度计测定数据证实了研究中重组蛋白的这一预期:单体在总蛋白浓度为1-50 nM时Zui丰富,四聚体在100 nM时Zui丰富(图2)。尽管总蛋白浓度发生变化,但二聚体比例大致保持不变。在上述示例中,质量光度计有效地测量了生理相关蛋白质浓度范围内每个低聚物物种的相对丰度。这种测量非常有用,因为低聚物状态通常与蛋白质活性直接相关。因此,样本中低聚物状态的知识可以为下游应用的决策提供信息。

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评估环境因素如何影响平衡

环境的物理和化学性质——如温度、离子强度或pH值——会影响蛋白质相互作用的平衡。将平衡的重组蛋白样品从37°C移至较低温度(室温)会扰乱系统的平衡,导致四聚体的相对比例随时间增加(图3A)。二聚体的比例再次保持不变(数据未显示)。

这些结果强调了在实验过程中严格控制温度和孵育时间的重要性,并证明快速质量光度计测量对于验证所研究系统的状态很有价值。相反,当重组蛋白在水中而不是在PBS中培养时,单体和四聚体数量的变化不太明显。出乎意料的是,我们观察到二聚体数量显著增加,尽管存在其他干扰,但在PBS稀释样品中二聚体数量先前保持不变(图3B),这说明了通过质量光度计进行单分子方法量化每个组分的重要性。

总的来说,对重组蛋白的三组测量表明,使用质量光度计在单个分子水平上监测样本中的所有蛋白质物种,可以对难以分析的多步骤反应提供有价值的见解。

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总结

涉及蛋白质相互作用和其他大分子相互作用的系统通常很复杂,使得体积测量难以解释。由于其单分子性质,质量光度计通过提供样品中所有组分的信息克服了这一挑战(前提是感兴趣组分之间的分子质量存在足够的差异)。质量光度计可在一定时间或条件下轻松监测溶液中样品所有组分的相对浓度,无需任何蛋白质标记或固定。在这种方法的基础上,最近发表的文章详细描述了从质量光度计数据计算平衡常数。

 


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