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PCR仪的测序反应试验讲解

点击次数:118 发布时间:2021-07-23
   PCR仪进行测序反应试验时应按照步骤依次进行:
  1.取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,加入规定试剂。总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。将PCR管置于PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃10秒,50℃5秒,60℃4分钟,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
  醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物:
  1.将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml EP管中;
  2.加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃离心30min,小心弃上清;
  3.加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10-15min。
  电泳前测序PCR产物的处理:
  1.加入12μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心;
  2.将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中,稍离心;
  3.在PCR仪上进行热变性(95℃2min),冰中骤冷,待上机。
  具体上机操作按PCR仪说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kV预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kV,20min),在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
  仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
  测序完毕按PCR仪操作规程进行仪器清洗与保养。
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