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应用案例(质量光度计-OneMP):质量光度计在核酸方面的应用

点击次数:110 发布时间:2021-09-29

应用案例(质量光度计-OneMP):质量光度计在核酸方面的应用

Mass photometry of nucleic acids

翻译整理:北京佰司特贸易有限责任公司

质量光度法可以定量测定溶液中生物分子的质量分布。它用于分析蛋白质的纯度,表征他们的低聚态和定量他们的蛋白质-蛋白质相互作用是建立的。然而,它在表征其他生物分子(包括核酸)方面的应用研究较少。在这里,我们展示了如何使用质量光度法来测量1005000个碱基对范围内的DNA的质量、大小和丰度。

质量光度法(MP)是一种新的分析技术,它利用单个生物分子散射的光来测量它们的质量。在MP测量中,当分子遇到质量光度计覆盖的玻璃-水界面时,检测到溶液中单个分子散射的微量光。散射光的量与分子的质量成线性关系。因此,通过一个简单的校准,不同种类分子的分子质量可以被精确地确定。

在这篇应用笔记中,我们概述了如何应用MP测量核酸,包括制备和校准的步骤。我们还展示了从低质量阶梯到整个质粒的DNA测量示例。

核酸测量的准备工作

DNARNA在溶液中都带负电荷,这意味着它们往往会被未处理的盖玻片排斥。因此,核酸表现出很少和短暂的结合。这导致MP数据中很少且定义不明确的事件,解绑定的事件和绑定的事件一样多(1)

为了克服这种瞬态行为,覆盖表面可以功能化成为带正电荷的,增加它与带负电荷的核酸的相互作用。为了实现这种功能化,玻璃表面可以用APTES2或聚赖氨酸(PLL)进行处理。

用锁相环覆盖在玻璃上大大增强了检测能力,结合事件的数量显著增加(解除结合的数量减少)(1)。低质量DNA ladder的所有6个组成部分,跨度从1002000个碱基对(63 kDa 1242 kDa)。这说明MP可以用来测量溶液中核酸的质量分布。

核酸质量校准

质量光度法(MP)是一种新的分析技术,它利用单个生物分子散射的光来测量它们的质量。在MP测量中,当分子遇到质量光度计覆盖的玻璃-水界面时,检测到溶液中单个分子散射的微量光。散射光的量与分子的质量成线性关系。因此,通过一个简单的校准,不同种类分子的分子质量可以被精确地确定。

在这篇应用笔记中,我们概述了如何应用MP测量核酸,包括制备和校准的步骤。我们还展示了从低质量阶梯到整个质粒的dna测量示例。

核酸测量的准备工作

DNARNA在溶液中都带负电荷,这意味着它们往往会被未处理的盖玻片排斥。因此,核酸表现出很少和短暂的结合。这导致MP数据中很少且定义不明确的事件,解绑定的事件和绑定的事件一样多(1)

                                               

1未处理与功能化玻璃上核酸的测量值。DNA阶梯叠加在未处理(中蓝色)和聚赖氨酸涂层(灰色/深蓝色)玻璃上。分子质量(kDa)采用DNA校准,假设一个碱基对等于660 Da

为了克服这种瞬态行为,覆盖表面可以功能化成为带正电荷的,增加它与带负电荷的核酸的相互作用。为了实现这种功能化,玻璃表面可以用APTES2或聚赖氨酸(PLL)进行处理。

用锁相环覆盖在玻璃上大大增强了检测能力,结合事件的数量显著增加(解除结合的数量减少)(1)。低质量DNA ladder的所有6个组成部分,跨度从1002000个碱基对(63 kDa)

1242 kDa)是很好的解决。这说明MP可以用来测量溶液中核酸的质量分布。

核酸质量校准

 


2 DNA与蛋白质校准比较。不同的核苷酸和氨基酸折射率导致不同的DNA和蛋白质校准曲线的斜率。这并不影响测量,但影响分析物分子质量的计算。

MP可应用于多种生物分子。然而,不同类型的分子的折射率不同。因此,为了正确地将测量的对比与分子质量相关联,应该使用已知质量和与分析物相同分子类别的分子进行适当的校准。对不同分子类别的标定均显示出对比度和质量之间普遍的线性相关关系,但斜率不同(2)

至于校准蛋白质的测量,可用的商业标准可用于校准DNA的测量。凝胶电泳的DNA阶梯(1碱基对= 660道尔顿)的一次测量就足以进行准确的校准(2)。通过这些简单的准备,MP可以用来测量未知成分的DNA样品的质量(或碱基对的数量)

测量核酸

为了证明MP测量对核酸的实用性,我们使用最小样本(3 ng)确定了PCR产物的质量和均匀性。测量结果显示,在218 kDa处有一个对称峰,相当于331 bp(3),与预期长度335 bp接近。


3 PCR产物验证结果显示其同源性。PCR产物的MP测定得到了分子量为218 kDa的单峰。用DNA标准曲线进行校正,长度为331 bp(预期长度为335 bp)

为了测试更大的DNA物种是否能够以同样的精度进行分析,我们测量了质粒pUC18(4)。在2683 bp处观察到丰富的峰,相当于1773 kDa。检测到的DNA片段长度约为5000 bp,短于1000 bp


4质粒的验证显示了质粒的异质性。质粒pUC18MP测定显示一个主峰,分子量为1773 kDa。使用DNA标准曲线进行校正,结果显示完整质粒的长度为2683 bp(预期长度: 2686bp)。同时检测到高、低质量的DNA种类。

这种测量突出了MP适用的宽质量范围,以及测量的单分子性质所提供的高动态范围。

综上所述,MP是一种令人兴奋的替代现有核酸定量技术。它允许使用非常少的样品进行质量测定和纯度评估,只需几分钟,并且不需要任何污渍。


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