2025年3月。河南大学抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室的科研工作者于在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上发表“Attenuation of cardiac ischemia/reperfusion injury via the decoy receptor DcR2 by targeting the PLAD domain of the death receptor DR5"论文。

本研究旨在确定 DcR2 的作用靶点，并探究 DcR2 在小鼠心肌 I/R 损伤中的保护机制。结果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白对心肌缺血/再灌注损伤具有显著的保护作用。DcR2 通过其 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物，该结构域不具有完整的死亡结构域，因而无法向下游传递信号。此外，复合物的形成掩盖了与配体 TRAIL 相互作用的位点，从而减轻了缺血/再灌注损伤后的心肌细胞死亡。因此，本研究揭示了 DcR2 的 PLAD 结构域在抑制细胞凋亡中起关键作用，为新型药物的研发提供了潜在靶点。

Lijie Zhang, Xinyuan Zhang, Ziting Li, Tingting Mo, Wanting Feng, JingLun Zhang, Dan Zhao, Ying Wang, Yinxiang Wei, Yaohui Wang

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, the First Affiliated Hospital, Henan University, Kaifeng, China

School of Medicine, Henan University, Kaifeng, China

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering, Henan University, Kaifeng, China

Zhou, D. et al.

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度（Tm）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

前言

缺血缺氧导致的心肌细胞死亡是心肌损伤的主要原因。DcR2 是 TRAIL 的诱骗受体，DcR2 在心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中的作用尚不清楚。近期研究表明，DcR2 不仅作为受体与 TRAIL 结合，还能作为 DR5 的配体在体外阻断 TRAIL 诱导的细胞凋亡，但 DcR2 在体内对 TRAIL 或 DR5 的亲和力偏好尚不清楚。我们的研究发现，hDcR2-Fc 融合蛋白在小鼠心肌 I/R 损伤模型中发挥心脏保护作用，通过减少细胞凋亡来实现。亲和力测定表明，DcR2 对 DR5 的亲和力大于对 TRAIL 的亲和力，且 DcR2 更倾向于与 DR5 结合。机制研究表明，PLAD 的缺失消除了 hDcR2-Fc 对 I/R 引起的心肌损伤的保护作用。DcR2 通过类似的 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物。综上所述，本研究揭示了 DcR2 可通过 PLAD 结构域靶向 DR5 形成异源复合物，阻断细胞凋亡，从而改善心肌 I/R 损伤，为心肌 I/R 损伤的治疗提供了新的预防策略。

01 简介

急性心肌梗死（AMI）是一种严重威胁人类生命健康的疾病，全球范围内 AMI 的死亡率仍然很高。由缺血缺氧引起的心肌细胞死亡是一种不可逆的损伤。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）能有效降低急性心肌梗死患者的死亡率，但存在两大难题，即治疗的黄金时间短以及缺血/再灌注（I/R）损伤。此外，长期心力衰竭的发生率也很高。为了缩小心肌梗死的范围，延长心肌细胞死亡的“窗口期"，改善患者的长期预后，需要研发能够减少或逆转心脏损伤的新疗法。

心肌梗死通常伴有多种病理变化，其中最严重的是心肌细胞凋亡。然而，临床上尚无治疗心肌细胞凋亡的有效策略。因此，寻找预防心肌细胞凋亡的关键靶点可能为心肌梗死的预防和治疗提供新的策略。肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL），也称为Apo2配体，属于TNF配体超家族。迄今为止，人类已鉴定出五种TRAIL受体。DR4（TRAIL-R1）和DR5（TRAIL-R2）被称为死亡受体（DRs），它们具有完整的死亡结构域（DD），能够传递由TRAIL调节的死亡信号。DRs介导相关下游信号通路的激活，从而导致细胞凋亡，其中DR5是主要的死亡受体。我们之前的研究证实sDR5-Fc融合蛋白可以特异性阻断TRAIL-DR5通路，从而改善猴、猪、大鼠心肌梗死后的心功能。

诱骗受体 1（DcR1）、诱骗受体 2（DcR2）和骨保护素（OPG）是已知的诱骗受体，它们缺乏功能性的死亡结构域，不能传递凋亡信号，从而保护细胞免受 TRAIL 诱导的死亡 [12,13]。目前关于 DcR2 的研究主要集中在它在各种肿瘤细胞 TRAIL 耐药机制中的作用上。抗凋亡在心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中起着重要作用，但 DcR2 在心肌 I/R 损伤中的作用尚未见报道。近期研究表明，DcR2 不仅作为受体与 TRAIL 结合，还在体外作为 DR5 的配体来阻断 TRAIL 诱导的细胞凋亡 [14-16]。DcR2 通过位于 TNFR 氨基末端的富含半胱氨酸结构域 1（CRD1）的重叠区域——前配体组装结构域（PLAD）与 DR5 相互作用，形成无功能的异源复合物。DcR2 在体内更倾向于与 TRAIL 还是 DR5 结合尚不清楚。在本研究中，我们旨在确定 DcR2 的作用靶点，并探究 DcR2 在小鼠心肌 I/R 损伤中的心肌保护机制。结果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白对心肌缺血/再灌注损伤具有显著的保护作用。DcR2 通过其 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物，该结构域不具有完整的死亡结构域，因而无法向下游传递信号。此外，复合物的形成掩盖了与配体 TRAIL 相互作用的位点，从而减轻了缺血/再灌注损伤后的心肌细胞死亡。因此，本研究揭示了 DcR2 的 PLAD 结构域在抑制细胞凋亡中起关键作用，为新型药物的研发提供了潜在靶点。

02 材料与方法

2.1. 蛋白质表达与纯化

为了获得具有高生物活性的融合蛋白，在人 DcR2 的 C 末端和 N 末端构建了带有 Fc 标签的重组质粒。合成了编码人 DcR2 胞外区（1-156）的基因，并通过重叠 PCR 获得了 hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 片段。将 hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 分别插入到具有 HindIII/EcoRI 和 BamHI/XhoI 限制性内切酶位点的 pcDNA3.1 质粒中。这些重组质粒被瞬时转染到 293F 细胞中进行真核表达。在转染后 5 天收集细胞上清液，并通过蛋白 A 亲和层析纯化 hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 融合蛋白。合并峰值组分，并通过 SDS-PAGE 和 Western blotting 进行评估。

通过重叠 PCR 构建了 PLAD 区域缺失的重组质粒 pcDNA3.1-DcR2ΔPLAD-Fc，利用 Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2（C215，Vazyme）构建了 N 连接糖基化位点突变的重组质粒 pcDNA3.1-Mu-N-Gly-DcR2-Fc。随后按照 hDcR2-Fc 蛋白的表达和纯化方法获得了这两种蛋白。通过 PCR 构建了 pcDNA3.1-hDcR2-His 重组质粒，将其转染至 293F 细胞培养 5 天，收集细胞上清液。通过镍亲和柱纯化重组 hDcR2-His 蛋白。

2.2.  Western blotting印迹法

在蛋白质表达和纯化过程中收集并制备了蛋白质样本。在蛋白酶/磷酸酶抑制剂存在的情况下，将心脏组织在裂解缓冲液中匀浆。通过二喹啉甲酸（BCA）法（AR0197，博士德）对蛋白质样本进行定量。将样本通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用 5%脱脂奶粉封闭，然后依次用指定的一抗和二抗进行孵育。随后通过增强化学发光法检测免疫反应蛋白，并通过 ImageJ 软件进行分析。用于蛋白质印迹分析的抗体包括：抗人 IgG Fc 片段抗体
（ab97225，Abcam，1:2000 稀释），抗 TRAIL（PA5-80165，Thermo Fisher，1:500 稀释），抗 DR5（ab8416，Abcam，1:500 稀释），抗 DcR2（A3581，ABclonal，1:500 稀释），抗裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（9664，Cell Signaling Technology，1:1000 稀释），抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 8（ab25901，Abcam，1:1000 稀释），抗 Bak（3814，Cell Signaling Technology，1:1000 稀释），抗 Bcl-2（15,071，Cell Signaling Technology，1:1000 稀释）以及抗 GAPDH（AC002，ABclonal，1:5000 稀释）。

2.3. 在Jurkat细胞中进行的细胞凋亡及细胞凋亡阻断实验

Jurkat 细胞在含 L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的 1640 培养基中培养。将 Jurkat 细胞以每孔 5 ×10-5 个细胞的密度接种于 12 孔板中，再培养 6 小时。加入 TRAIL 蛋白（200 ng/mL）诱导细胞凋亡，在细胞凋亡阻断实验中，同时将 hDcR2-Fc、DcR2ΔPLAD-Fc 和 Mu-N-Gly-DcR2-Fc 与 TRAIL 共同孵育。随后，用 Annexin V-APC 和 7-AAD（杭州多瑞生物科技有限公司）对细胞进行标记，然后进行流式细胞术分析。

2.4. 小鼠的 I/R 模型生成、梗死面积及组织学检查

雄性 C57BL/6N 小鼠（6 - 8 周龄，20 - 22 克）饲养于河南大学动物中心（中国开封），自由采食饮水。适应一周后，将小鼠随机分为三组（每组 6 只）：假手术组（sham）、缺血再灌注 + PBS 组（I/R + PBS）和缺血再灌注 + 人 DcR2-Fc 组（I/R + hDcR2-Fc）。通过结扎左前降支冠状动脉（LAD）40 分钟构建缺血再灌注损伤模型，手术后松开结扎线，再灌注 24 小时。假手术组小鼠接受相同的手术操作，但不结扎冠状动脉。通过尾静脉注射单剂量的人 DcR2-Fc。冠状动脉再灌注后，将结扎线松开置于心脏表面。再灌注 24 小时后，取出小鼠心脏并切成小块。用 1% 三苯基氯化四氮唑（TTC）（美国西格玛奥德里奇公司）在 37℃ 下染色 20 分钟确认心肌梗死，通过主动脉注射伊文思蓝确定危险区域（AAR）。通过 ImageJ 软件测量心肌梗死面积（IS）。所有研究均获得河南大学动物护理与使用委员会的批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于动物护理和使用的指南。

2.5. 小鼠心脏的组织学分析

心脏组织用 4%多聚甲醛固定 48 小时，然后包埋于石蜡中，并切成 5 微米厚的连续切片。切片在 65℃烘箱中烘烤 2 小时后，进行脱蜡和水化处理。切片用苏木精-伊红染色液（上海金穗公司，JR20570）进行 HE 染色。染色完成后，通过显微镜（奥林巴斯 IX53）对病理切片进行拍照。
采用 TUNEL 染色法（A113，TUNEL 凋亡检测试剂盒，Vazyme）分析细胞凋亡情况，操作步骤依照制造商说明进行。将心脏组织脱蜡、水化，用蛋白酶 K 透化，于 37℃反应缓冲液中处理 60 分钟，然后用 DAPI（C0060，索莱宝）复染 5 分钟。在荧光显微镜（尼康 A1R Storm）下观察 TUNEL 染色阳性信号。

免疫组化染色时，将重新水合的切片在室温下用 3% H₂O₂ 孵育 20 分钟，随后用柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）处理以修复抗原。切片在室温下用封闭缓冲液（5% BSA）封闭 30 分钟，然后在 4 ◦C 下与针对裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（9664，CST，1:2000 稀释）、TRAIL（PA5-80165，Thermo Fisher，1:500 稀释）和 DcR2（A3581，ABclonal，1:50 稀释）的一抗孵育过夜。切片通过 3,3'-用四盐酸盐二氨基联苯胺（DAB）（8059，Cell Signaling Technology 公司）进行染色，然后用苏木精复染，再经过脱水处理后封片。通过光学显微镜（奥林巴斯 IX53）观察染色切片，并使用 ImageJ 软件进行分析。

2.6. 多柔比星诱导的急性心脏毒性模型及超声心动图（Echo）

经过一周的适应期后，将 6 - 8 周龄、体重 20 - 22 克的雄性 C57BL/6 小鼠随机分为三组（每组 6 只）：对照组（正常组）、多柔比星治疗组（多柔比星组）和多柔比星治疗联合人 DcR2-Fc 注射组（多柔比星 + hDcR2-Fc 组）。多柔比星组和多柔比星 + hDcR2-Fc 组小鼠接受腹腔注射多柔比星（20 毫克/千克；美中生物），而正常组则注射等量的 PBS。多柔比星 + hDcR2-Fc 组在多柔比星给药前一天和给药当天接受静脉注射 DcR2-Fc（8 毫克/千克），而多柔比星组则注射等量的 PBS。在多柔比星给药后 4 天，通过经胸超声心动图检测心脏功能。使用 Visual Sonics Vevo 1100 成像系统（Visual Sonics 公司）进行经胸超声心动图检查，采用 30 兆赫的探头（MX400）。所有小鼠均在 1.5% 异氟烷和 100% 氧气的麻醉下进行检查，在乳头肌水平获取二维靶向 M 型轨迹。测量左心室收缩期和舒张期后壁及前壁的厚度。所有参数均在至少连续 6 个心动周期内进行测量。采用平均值来计算左心室射血分数和左心室短轴缩短率。

2.7. BLI 检测

通过 Octet R8 仪器测量蛋白质 - 蛋白质相互作用。将带有 Fc 标签的 hDR5-Fc 固定在 AHC 生物传感器芯片上，然后以不同浓度结合 hTRAIL（h，人）和 hDcR2-His 蛋白质。同样，将带有 Fc 标签的 hDcR2-Fc 固定在 AHC 生物传感器芯片上，然后以不同浓度结合 hTRAIL 和 mTRAIL（m，小鼠）蛋白质。将带有 His 标签的 hTRAIL 固定在 His1k 生物传感器芯片上，然后以不同浓度结合 DcR2ΔPLAD-Fc 和 Mu-N-Gly-DcR2-Fc 蛋白质。同样，将带有 His 标签的 mTRAIL 固定在 His1k 生物传感器芯片上，然后测定不同浓度的 hDR5-Fc 蛋白质的结合情况。使用 Octet 数据分析软件将数据拟合到 1:1 结合模型中，以提取结合和解离速率。通过 Koff/Kon 比值计算 KD 值。

2.8. 蛋白热稳定性研究

融合蛋白的热稳定性通过 PSA-16 型仪器（北京佰司特科技有限责任公司）测定[17]。将样品稀释至 0.5 毫克/毫升，取 20 微升稀释后的样品装入石英玻璃管（货号：LG-002，北京佰司特科技有限责任公司）。在 30 至 90 摄氏度的线性温度扫描范围内，以每分钟 1 摄氏度的升温速率测量 330 纳米和 350 纳米处的固有蛋白质荧光强度。根据 F350/F330 曲线的斜率计算热变性中点（Tm）。每个样品测量三次。

2.9. 数据分析

结构图示通过 PyMOL生成。不同蛋白质的氨基酸序列通过 Clustal Omega进行比较。所有数据均来自至少 3 次独立实验，并以平均值 ± 平均值的标准误差（SEM）表示。两组之间的统计比较通过学生 t 检验进行。组间差异通过分析得出。
通过单向方差分析（one-way ANOVA）并采用 Dunnett 检验进行后续分析。统计分析使用 GraphPad Prism 9.5 版软件完成。所有分析中，P < 0.05 被认为具有显著差异。

03 结果

3.1. DcR2 融合蛋白的制备与表征

为了比较 Fc 标签位于 N 端和 C 端对 DcR2 功能的影响，同时构建了 C 端和 N 端带有 Fc 标签的 pcDNA3.1-hDcR2-Fc 和 pcDNA3.1-Fc-hDcR2 重组质粒（图 1A）。随后将 pcDNA3.1-hDcR2-Fc 重组质粒转染到 293F 细胞中进行扩增培养，并通过蛋白 A 亲和层析进行蛋白纯化（图 1B）。结果表明，hDcR2-Fc 以二聚体形式存在。通过凝胶层析进一步纯化发现，hDcR2-Fc 是一种大小在 45 至 75 kDa 之间的糖蛋白，这与理论分子量相符（图 1C）。同样通过蛋白 A 亲和层析对 Fc-hDcR2 进行了真核表达纯化（图 1D）。结果表明，Fc-hDcR2 为糖蛋白，大小在 45 至 75 kDa 之间，表明 Fc-hDcR2 蛋白已成功获得。

流式细胞术表明，hDcR2-Fc 和 Fc-hDcR2 均能有效阻断 TRAIL 诱导的 Jurkat 细胞凋亡，且阻断效果随蛋白浓度的增加而增强（图 1E）。hDcR2-Fc 的阻断效果优于 Fc-hDcR2，因此后续实验均使用 hDcR2-Fc。

3.2. hDcR2-Fc 可减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤并改善心脏功能

为了确定 hDcR2-Fc 在心肌缺血再灌注损伤中的作用，通过结扎 C57BL/6N 小鼠的左前降支（LAD）动脉 40 分钟，随后再灌注 24 小时来诱导心肌缺血，并在再灌注前 5 分钟通过静脉注射不同浓度的 hDcR2-Fc 或 PBS。PBS 作为对照。整个实验过程为双盲实验。通过 TTC-伊文思蓝染色评估 hDcR2-Fc 对小鼠心肌梗死面积的影响（图 2A）。与 PBS 组相比，用 hDcR2-Fc 处理的小鼠心肌梗死面积显著减小，且 hDcR2-Fc 在体内的保护作用呈剂量依赖性（图 2B）。用 8 毫克/千克 hDcR2-Fc 融合蛋白处理可使梗死面积减少最多，用 8 毫克/千克 hDcR2-Fc 处理的小鼠心肌梗死面积/危险区面积（IS/AAR）比值降低了 30.48%，而梗死面积/左心室面积（IS/LV）比值降低了 18.65%。结果表明，hDcR2-Fc 通过减少心肌缺血再灌注损伤来发挥心肌保护作用。HE 染色结果显示，缺血再灌注（I/R）损伤所导致的病理损害，如心肌细胞肥大和炎症细胞浸润，在经 hDcR2-Fc 治疗后显著改善（图 2C）。这些数据表明，hDcR2-Fc 能够减轻 I/R 损伤所诱导的细胞凋亡程度，并改善心肌损伤。

我们之前的研究报告称，心肌缺血再灌注（I/R）损伤后，TRAIL 和 DR5 的表达上调[11]。为了进一步探究 hDcR2-Fc 如何发挥心肌保护作用，我们检测了心肌 I/R 损伤小鼠中 TRAIL、DR5 和 DcR2 的表达情况。免疫组化结果和蛋白质印迹分析发现，I/R 损伤后小鼠梗死区 TRAIL、DR5 和 DcR2 的蛋白水平显著升高（图 2D-G）。hDcR2-Fc 可降低心肌梗死区 TRAIL 的表达，并上调 DcR2 的表达。

3.3. hDcR2-Fc 通过阻断细胞凋亡途径发挥心肌保护作用

抗凋亡在心肌缺血/再灌注损伤中起着重要作用，我们接下来研究了人 DcR2-Fc 融合蛋白对细胞凋亡相关通路的影响。促凋亡蛋白裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8、Bak 和 Bax 的表达显著增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达则显著降低（图 2G-I）。此外，hDcR2-Fc 可逆转这些表型。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）检测和 HE 染色来检测心肌梗死组织中的细胞凋亡情况并评估病理变化（图 2J）。与假手术组相比，心肌缺血/再灌注损伤后凋亡心肌细胞的数量显著增加，而使用 hDcR2-Fc 治疗则显著减少了凋亡心肌细胞的数量。总之，结果表明 hDcR2-Fc 可通过内在和外在途径抑制细胞凋亡的激活。

为了通过抑制细胞凋亡来确定 DcR2-Fc 在其他心脏疾病中的保护作用，建立了阿霉素诱导的急性心脏毒性模型（图 S1A）。C57BL/6 小鼠在阿霉素给药前一天和给药后一天分别接受 DcR2-Fc 或 PBS 的静脉注射，PBS 作为对照。超声心动图结果显示，与正常组相比，阿霉素组小鼠的左心室射血分数（EF%）和短轴缩短率（FS%）显著降低（图 S1B-C）。然而，与阿霉素组相比，接受 hDcR2-Fc 治疗的小鼠心脏功能得以良好维持。蛋白质印迹分析显示，阿霉素处理的小鼠心脏组织中促凋亡蛋白 Bax 的表达显著增加，而抗凋亡蛋白 BCL2 的表达显著降低（图 S1D）。此外，hDcR2-Fc 逆转了这些表型。这些结果表明，DcR2 通过抑制细胞凋亡的内在和外在途径的激活，在心脏保护中发挥着作用。

为了确定 PLAD 是否介导 DcR2 与 DR5 的结合，我们制备了 PLAD 结构域缺失的 DcR2ΔPLAD-Fc 融合蛋白。PLAD 结构域的去除并未影响DcR2 的二级结构，但其熔解温度（Tm）略有下降，表明其稳定性有所减弱。随后测定 DcR2APLAD-Fc 与 TRAIL 的亲和力为 4.724×10-7 M，略低于野生型。细胞凋亡阻断实验的结果表明，去除 PLAD 结构域后 DcR2 无法阻断细胞凋亡，这证实了 PLAD 结构域的重要性。相关通路。促凋亡蛋白裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8、Bak 和 Bax 的表达显著增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达则显著降低（图 2G-I）。此外，hDcR2-Fc 可逆转这些表型。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）检测和 HE 染色来检测心肌梗死组织中的细胞凋亡情况并评估病理变化（图 2J）。与假手术组相比，心肌缺血/再灌注损伤后凋亡心肌细胞的数量显著增加，而使用 hDcR2-Fc 治疗则显著减少了凋亡心肌细胞的数量。总之，结果表明 hDcR2-Fc 可通过内在和外在途径抑制细胞凋亡的激活。

为了通过抑制细胞凋亡来确定 DcR2-Fc 在其他心脏疾病中的保护作用，建立了阿霉素诱导的急性心脏毒性模型（图 S1A）。C57BL/6 小鼠在阿霉素给药前一天和给药后一天分别接受 DcR2-Fc 或 PBS 的静脉注射，PBS 作为对照。超声心动图结果显示，与正常组相比，阿霉素组小鼠的左心室射血分数（EF%）和短轴缩短率（FS%）显著降低（图 S1B-C）。然而，与阿霉素组相比，接受 hDcR2-Fc 治疗的小鼠心脏功能得以良好维持。蛋白质印迹分析显示，阿霉素处理的小鼠心脏组织中促凋亡蛋白 Bax 的表达显著增加，而抗凋亡蛋白 BCL2 的表达显著降低（图 S1D）。此外，hDcR2-Fc 逆转了这些表型。这些结果表明，DcR2 通过抑制细胞凋亡的内在和外在途径的激活，在心脏保护中发挥着作用。

3.4. DcR2 与 DR5 的亲和力大于 DcR2 与 TRAIL 的亲和力

DcR2 最初被发现是 TRAIL 的诱骗受体，因为它与 DR4 和 DR5 竞争 TRAIL 结合位点[19]。然而，由于 DcR2 与 TRAIL 的亲和力较低，它可能无法实现竞争性结合。近年来，越来越多的研究表明，DcR2 是一种“调节性"而非“诱饵"受体，它通过与 DR5 结合形成不依赖配体的异源复合物来抑制细胞凋亡信号传导[14-16]。在此，我们通过生物膜干涉（BLI）技术检测了 DcR2 对 TRAIL/DR5 的亲和力（图 3）。人 DR5-Fc（hDR5-Fc）与人 TRAIL（hTRAIL）以典型的慢结合/慢解离动力学相结合（kon = 5.364 ×10-4 M−1 s−1，koff = 4.160 ×10−7 s−1)，平衡解离常数（KD）测定为 7.755 ×10−12 M（图 3A、F）。DR5-Fc 与小鼠 TRAIL（mTRAIL）的结合亲和力（KD）计算为 4.389 ×10−8 M（图 3B）。带有 C 末端 His 标签的 DcR2 蛋白从 293F 细胞中表达并纯化。DcR2 与 hDR5 的结合常数（Kd）计算为 5.301 ⏛ M（图 3C），DcR2 与 hTRAIL 之间的相互作用亲和力为 3.066 ⏡ M（图 3D）。这些结果表明，DcR2 对 DR5 的亲和力大于对 TRAIL 的亲和力，推测 DcR2 可能倾向于与 DR5 结合。为了更好地分析小鼠 I/R 损伤模型中的实验结果，我们测试了不同物种之间的亲和力，发现 DcR2 与 mTRAIL 的亲和力为 6.123 ⏬ M（图 3E），这比 hDR5 与 mTRAIL 的亲和力大得多。蛋白质序列比对结果显示，小鼠 TRAIL 受体 mTRAIL-R 与 DcR2 的同源性高于与 hDR5 的同源性。这一发现也可以解释在小鼠 I/R 损伤模型中，较低剂量的 hDcR2-Fc 融合蛋白（8 mg/kg）比 hDR5-Fc（30 mg/kg）具有更好的心脏保护作用。

3.5. 在缺血/再灌注损伤中，DcR2 与 DR5 之间的配体非依赖性相互作用抑制了 TRAIL 诱导的细胞凋亡

先前的研究表明，DcR2 和 DR5 可能通过 PLAD 结构域结合。DR5 三聚体复合物的结构显示，在一个结构模型中存在两个不重叠的相互作用界面[20]。界面 1 的特征是单个单体的 CRD1 插入到相邻单体的拱形结构中（图 4A）。界面 2 的特征是单个单体的 CRD2 和 CRD3 分别与另一个单体的 CRD2 和 CRD1 相互作用（图 4A）。CRD1 是介导配体前聚集的主要 PLAD，参与了界面 1 和界面 2，尽管 CRD2 和 CRD3 也参与了分子间的相互作用（图 4B）。此外，DR5/DcR2 自关联复合物的形成掩盖了与配体 TRAIL 相互作用的位点。上述结构数据分析表明，PLAD 是 DR5 自关联的关键区域。DR5-TRAIL 复合物的 3:3 三维结构显示，三个 sDR5 分子之间没有相互作用，它们围绕着同源三聚体 TRAIL 以三角形位置排列（图 4C）。DR5 上的两个环，即 CRD2 中的 50s 环（残基 51 - 65）和 CRD3 中的 90s 环（残基 91 - 104），介导了与 TRAIL 的大部分相互作用，而 CRD1 或 PLAD 并不参与受体 - 配体的相互作用[21]。蛋白质序列比对结果还显示，DcR2 的 CDR1 区域与 DR5 的同源性更大（图 4D）。

为了确定 PLAD 是否介导 DcR2 与 DR5 的结合，我们制备了 PLAD 结构域缺失的 DcR2ΔPLAD-Fc 融合蛋白（图 5A）。PLAD 结构域的去除并未影响DcR2 的二级结构，但其熔解温度（Tm）略有下降，表明其稳定性有所减弱（图 5B）。随后测定 DcR2APLAD-Fc 与 TRAIL 的亲和力为 4.724×10-7 M，略低于野生型（图 5C）。Jurkat 细胞凋亡阻断实验的结果表明，去除 PLAD 结构域后 DcR2 无法阻断细胞凋亡，这证实了 PLAD 结构域的重要性（图 5D）。我们进一步研究了 DcR2APLAD-Fc 融合蛋白在小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中的作用。令人惊讶的是，我们的研究结果表明，删除 PLAD 结构域消除了 DCR2-Fc 对缺血/再灌注所致心肌损伤的保护作用（图 5E-F）。综上所述，这些结果表明 DcR2 通过其 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物，从而阻断缺血诱导的细胞凋亡，保护心脏免受损伤。

3.6. N-糖基化缺陷的 DCR2 仍能阻断细胞凋亡

目前，关于 DcR2 糖基化作用的研究尚不充分，糖基化如何调节 TRAIL 诱导的细胞凋亡以及 DcR2 与受体和配体的结合机制仍不清楚。由于 N 连接糖基化（N-糖基化）在肿瘤坏死因子（TNF）家族的其他成员中起着调节作用，我们研究了 N-糖基化对 DcR2 功能的调节作用[22,23]。虽然人类 DR5 序列中没有潜在的 N-糖基化位点，但人类 DR4 的 CRD2 区域在 156 位的天冬酰胺上存在 N-糖基化（22）。DeR2 在 95、139 和 150 位的三个天冬酰胺上具有三个潜在的 N-糖基化位点（图 4D）。为了探究 N-糖基化对 DeR2 功能的影响，将 DCR2 的三个 N-糖基化位点从天冬酰胺突变为谷氨酰胺（图 6A）。首先，测试了蛋白的稳定性，热变性曲线显示突变后 Tm 值略有下降（图 6B）。接下来，N-糖基化缺陷型 DcR2 对人 TRAIL 的亲和力为 2.088×10-7 M，比野生型低一个数量级（图 6C）。N-糖基化缺陷型 DR2 蛋白仍能阻断 TRAIL 诱导的细胞凋亡（图 6D）。无论 DCR2 是否发生 N-糖基化，对 DeR2 功能的影响都很小，这表明可以继续开展 DcR2 的药物研究与开发工作。

作者进一步借助蛋白稳定性分析仪PSA-16，通过差示扫描荧光法（Differential scanning fluorimetry，DSF）原理进行NiV G-ferritin和NiV sG的热稳定性分析，结果表明，NiV G-ferritin和NiV sG表现出相似的热稳定性，Tm为~65°C，表明NiV G和ferritin的融合对其结构稳定性没有显著影响。

由于NiV G-ferritin可以诱导强大的体液免疫反应，研究者还从NiV G-ferritin免疫小鼠体内筛选、制备了一批单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）。在分离的27种mAbs中，25种mAbs可以有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）为骨架的NiV假病毒的感染，其抑制50%的NiV假病毒感染所需要的浓度（IC50）低于10 ng/mL。表位竞争分析发现，筛选得到的27个mAbs可以识别NiV G蛋白上4个不同的抗原表位，包括2个新的此前未被报道的表位。最后，研究者在尼帕病毒感染的致死模型（叙利亚金黄仓鼠）上评估了NiV G-ferritin诱导的免疫反应和保护效果。研究发现给与仓鼠2针或者3针的NiV G-ferritin后，仓鼠体内均产生了高中和活性的血清，且接种2次或者3次均能够帮助仓鼠100%的抵抗致死剂量NiV的攻击。研究者进一步检测了3针疫苗接种仓鼠体内的病毒RNA含量，结果发现，仓鼠的肺脏、脑和脾脏中均未检测到病毒RNA，表明三剂NiV G-ferritin抑制了病毒在仓鼠肺部、大脑和脾脏的复制。

04 讨论

本研究证明了 DcR2 在减轻 1/R 诱导的心脏损伤方面具有显著效果，并揭示了在小鼠 1/R 损伤疾病模型中，DcR2 更倾向于与 DR5 结合。为开展此项研究，我们表达并纯化了一系列蛋白质，包括 hDcR2-Fc、Fc-hDcR2、DR5-Fc、DR5-His、TRAIL、DCR2APLAD-Fc 和 Mu-N-Gly-DcR2-Fc（图 1A-D）。通过蛋白质特性分析，我们确定 hDcR2-Fc 具有更强的抗凋亡作用（图 1E）。在双盲条件下进行的小鼠心肌 1/R 损伤实验结果表明，hDcR2-Fc 融合蛋白通过减少心肌细胞凋亡程度发挥心脏保护作用（图 2）。先前的研究报告称，DcR2 还可作为 DR5 的配体，在体外阻断 TRAIL 诱导的细胞凋亡，但这一发现尚未在体内得到验证。我们的研究阐明了 DcR2 与 DR5 的亲和力大于其与 TRAIL 的亲和力，且 DcR2 更倾向于与 DR5 结合（图 3）。深入研究其机制后，我们发现 DcR2 通过类似的 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物（图 4）。由于缺乏完整的死亡结构域，DeR2-DR5 复合物无法激活下游的细胞凋亡信号，从而有效减轻了 1/R 引起的心脏损伤（图 5）。此外，我们对 DeR2 的 N 糖基化位点进行了突变，发现未进行 N 糖基化的 DeR2 蛋白仍能阻断细胞凋亡（图 6）。总之，本研究为治疗心肌 1/R 损伤提供了新的治疗靶点。
我们之前已证实 DR5-Fc 融合蛋白可通过靶向 TRAIL 来阻断细胞凋亡并发挥心脏保护作用[11,24]。在本研究中，我们进一步证明了通过靶向 DR5，DCR2通过与 DRS 形成无功能的异三聚体来阻止细胞凋亡。针对 TRAIL-DR5 通路的临床药物研发有所增加[25-27]。人类 TRAIL 有 5 种受体。过去，人们认为死亡受体 DR5 和 DR4 起主要作用，而对其他诱骗受体关注较少。我们的研究表明，在病理状态下，应更多地关注 TRAIL 的几种受体是如何平衡的。TRAIL 被认为是肿瘤治疗的治疗靶点，因为它能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响。目前，仅有一种药物——环化突变型 TRAIL（CPT）于 2023 年获批，而针对 TRAIL 开发药物的主要困难在于克服其耐药性[28]。多项研究将 TRAIL 耐药性与死亡受体和诱骗受体的比例改变联系起来，DR4/DR5 表达降低和诱骗受体表达增加可能导致 TRAIL 耐药性的产生[29-31]。我们的研究还表明，DcR2 的功能不容忽视。有必要进一步研究 DcR2 在癌症和其他疾病中的作用。

DcR2 的 PLAD 结构域是如何发挥作用的？作为一种死亡受体，DcR2 属于肿瘤坏死因子受体超家族，但与 TNFRI 及其他成员有所不同。首先，TNFR1 有四个 CRD 结构域，每个结构域包含三个二硫键，共 6 个半胱氨酸。而 Fas 和 DR4/DR5/DcR1/DcR2 只有三个 CRD 结构域，且只有部分 CRD1。DR4/DR5/DcR1/DcR2 的 CRD1 结构域只有一个二硫键。肿瘤坏死因子受体的配体前组装已被认为激活的必要前提。其他 TNFR 受体只能通过 PLAD 结构域自组装，而不能与其他受体结合。然而，DR5 和 DcR2 能够形成异三聚体复合物，因为 TNFR 家族成员在 CRD1 区域有更多的二硫键相互作用，而 DR4/DR5/DcR1/DcR2 在 CRD1 区域只有一个二硫键。此外，DR5 和 DcR2 的 CRD1 区域较短，且 DcR2 的 PLAD 结构域与 DRS 相似，因此它们能够形成复合物。还需要进一步研究来探索其中的详细机制。此外，我们还研究了 N-糖基化对 DCR2 功能的影响，并报告称未进行 N-糖基化的 DCR2 蛋白仍能发挥阻断细胞凋亡的作用，这为开发 DcR2 相关药物奠定了基础。

我们的研究存在一些局限性。在小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中证实了 hDcR2-Fc 的心脏保护作用，但小鼠诱骗受体 2（mDCTRAIL-R2）的氨基酸序列与人 DCR2 差异很大，仅有 27.37% 的同源性[32,33]。此外，小鼠 TRAIL 与人受体的相互作用很强[34]。由于猴和人的 TRAIL/TRAIL 受体具有高度相似性（84-99% 的同源性）[35]，有必要进一步在猴缺血/再灌注模型中探究 hDCR2-Fc 蛋白的心脏保护作用。hDCR2-Fc 在心肌缺血/再灌注损伤中的具体靶细胞尚未明确，还需要进一步研究以确定 DCR2-Fc 对关键心脏细胞（包括心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞）的影响。已发现 DR5 的 O 连接糖基化（O-glyc）可调节促凋亡信号，DR5 的 O-glyc 位点位于 CRD2 和 CRD3 内或其周围[22,23,36]。通过 NetOGlyc 预测 DCR2 的 O-glyc 位点，发现 DCR2 比 DR5 拥有更多的 O-glyc 位点，尤其是在 CRD1 区域。阐明 O-糖基化在 DeR 中的作用将是未来研究的有趣方向。

总之，我们的研究证明了 DCR2 在减轻急性心肌梗死后的再灌注损伤方面具有保护作用。机制研究阐明，DCR2 通过其 PLAD 结构域与 DR5 形成异源复合物，该结构域不具有完整的死亡结构域，因而无法诱导细胞凋亡级联反应。此外，复合物的形成掩盖了与配体 TRAIL 的结合位点，从而减轻了再灌注损伤后的心肌细胞死亡。本研究证实了针对 DR5 进行靶向治疗的可行性，并为开发针对 TRAIL-DRS 通路的临床药物提供了更广阔的发展空间。