详细介绍一下蛋白稳定性分析仪的工作原理
点击次数：67 更新时间：2026-02-01
蛋白稳定性分析仪核心是通过多种光学检测技术，在温度/化学梯度下同步监测蛋白构象、聚集与粒径变化，输出Tm、Tagg、粒径等关键参数，核心技术以无标记内源荧光（nanoDSF/ifDSF）为基础，常整合SLS、DLS等多模块实现多维度表征。以下从核心技术、模块协同、实验流程与数据解析四方面详细说明：
一、核心检测技术与原理
1.内源差示扫描荧光（nanoDSF/ifDSF）—构象稳定性核心
这是无标记检测蛋白热/化学变性的主流技术，无需添加染料，适配各类蛋白与缓冲体系。
激发与信号源：以280nm紫外光激发蛋白中色氨酸、酪氨酸，二者荧光特性随微环境改变而变化。
变性信号变化：蛋白天然构象中色氨酸位于疏水核心，荧光峰约330nm；变性时暴露到亲水环境，峰位移至350nm，仪器实时监测330nm/350nm荧光比值变化。
关键参数输出：
熔解温度（Tm）：荧光比值突变对应的温度，反映50%蛋白去折叠的温度。
起始变性温度（Tonset）：构象开始变化的温度，提示早期稳定性临界点。
化学变性浓度（Cm）：化学变性剂（如尿素）诱导50%变性的浓度，表征化学稳定性。
2.静态光散射（SLS）—聚集行为监测
聚焦蛋白聚集起始与程度，通过散射光强度关联分子量变化。
原理：激光照射样品，蛋白聚集时粒子尺寸与分子量增大，散射光强度成正比上升。
关键参数：聚集起始温度（Tagg），即散射光强度显著上升的温度，区分单纯构象去折叠与聚集路径。
优势：可量化聚集程度，适配低浓度样品早期聚集检测。
3.动态光散射（DLS）—胶体稳定性与粒径分析
用于检测蛋白粒径分布与胶体稳定性，反映分子间相互作用与聚集动力学。
原理：基于布朗运动，散射光强度随粒子运动产生波动，通过波动频率计算流体力学粒径（Rh）及分布。
核心应用：
监测升温/恒温过程中粒径增长与多分散性变化，区分单体、寡聚体与大聚集体。
计算第二维里系数（B22）、扩散相互作用参数（kd），量化蛋白间净相互作用（吸引/排斥），预测长期聚集倾向。
4.背反射（Backreflection）—大聚集体快速筛查
部分机型（如PrometheusPanta）搭载此模块，通过可见光散射衰减检测粒径>25nm的大聚集体，抗样品缺陷干扰，适合快速聚集筛查。
二、仪器模块协同工作流程
现代分析仪多为多模块集成，典型流程如下：
样品准备：将蛋白样品（通常5-20μL，浓度0.05-10mg/mL）加入石英毛细管/96孔石英板，确保密封防蒸发。
梯度设置：设定温度梯度（如25-95℃，升温速率0.1-5℃/min）或化学变性剂梯度（如尿素浓度0-8M）。
同步检测：
荧光模块：持续扫描330nm/350nm荧光比值，绘制构象变化曲线。
SLS模块：实时记录散射光强度，捕捉Tagg。
DLS模块：同步采集散射光波动，计算Rh与粒径分布。
数据采集：软件同步整合多模块信号，生成时间-温度-信号三维数据矩阵。
三、数据解析与核心参数
以热稳定性实验为例，数据处理流程如下：
荧光曲线拟合：对330nm/350nm比值-温度曲线求导，导数峰值对应Tm，曲线起始拐点为Tonset。
SLS信号阈值：设定散射光强度基线+3倍标准差为阈值，对应温度为Tagg。
DLS粒径分析：输出不同温度下的平均粒径、多分散指数（PDI），判断聚集类型（如单体→二聚体→大聚集体）。
综合判读：Tm低但Tagg高提示构象易变但不易聚集；Tm高但Tagg低提示构象稳定但易聚集，为配方优化提供方向。
四、典型应用场景与优势
药物研发：蛋白药物配方筛选（pH、缓冲液、添加剂优化），候选分子稳定性排序，配体结合亲和力评估（结合后Tm升高提示稳定）。
质量控制：生物药批次间稳定性一致性检测，加速老化实验预测长期储存稳定性。
基础研究：蛋白突变体稳定性分析，折叠机制研究，蛋白-蛋白/蛋白-小分子相互作用表征。
技术优势：无标记、低样品量、高通量（96/384孔）、多参数同步获取，缩短实验周期并降低成本。
总结来看，蛋白稳定性分析仪通过光学技术组合，实现从构象到聚集、从热稳定到胶体稳定的全维度表征，是生物药研发、质检与基础研究的核心工具。
上一篇：没有了
