超高速原子力显微镜HS-AFM+NanoDSF观察TRPV3通道五聚体

超高速原子力显微镜HS-AFM+NanoDSF观察TRPV3通道五聚体

超高速视频级原子力显微镜（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大学 Prof. Ando 教授团队研发，日本RIBM公司（生体分子计测研究所株式会社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商业化的产品，可以达到视频级成像的商业化原子力显微镜。HS-AFM突破了传统原子力显微镜“扫描成像速慢"的限制，能够在液体环境下超快速动态成像，分辨率为纳米水平。样品无需特殊固定，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。超高速视频级原子力显微镜HS-AFM主要有两种型号，SS-NEX样品扫描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探针扫描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今已有150多位用户，发表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等杂志。

相较于目前市场上的原子力显微镜成像设备，HS-AFM突破了 “扫描成像速慢"的限制，扫描速度高可达 20 frame/s，并且有 4 种扫描台可供选择。样品无需特殊固定染色，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。液体环境下直接检测，超快速动态成像，分辨率为纳米水平。探针小，适用于生物样品；悬臂探针共振频率高，弹簧系数小，避免了对生物样品等的损伤。悬臂探针可自动漂移校准，适用于长时间观测。采用动态PID控制，高速扫描时仍可获得清晰的图像。XY轴分辨率2nm；Z轴分辨率0.5nm。

HS-AFM不仅拥有超高扫描速率与原子级别分辨率，而且具有操作的简易性，使得对单分子动态过程的捕捉变得十分方便，为科研工作者研究和理解生物物理、生物化学、分子生物学、病毒学以及生物医学等领域的单分子动态过程提供了一款强大的工具。全新的HS-AFM采用了新的高频微悬臂架构，更低噪音、更高稳定性的控制器，高速扫描器，缓冲防震设计，主动阻尼，动态PID，驱动算法优化，多种前沿技术，可以实现在超高速下获取高分辨的生物样品信息。新系统整合了基于工作流程的操作软件，直观的用户界面与流程化、自动化的设置使得研究人员可以专注于实验设计，不需要复杂的操作和条件设置，快速获取数据，加速研究的产出。

目前已经解析了大量的瞬时受体电位通道TRP(transient receptor potential)家族的结构，显示都是四聚体，但关于TRPV通道的许多方面仍然知之甚少，包括孔膨胀现象（pore-dilation phenomenon）。科学家通过超高速原子力显微镜HS-AFM，在单分子水平上分析了膜嵌入的TRPV3，并发现了一种五聚体状态。并且通过NanoDSF进一步探究了 DPBA对TRPV3四聚体状态的破坏作用。

基因组DNA折叠形成环状以及拓扑关联结构域（Topologically associating domains，TADs），从而组成了基因组复杂的三维结构，这些三维结构具有重要的结构和调控作用。先前的研究已经逐渐揭示出基因组结构是由染色体结构维持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白复合物所介导的环挤出（DNA loop extrusion）过程形成的（图1）。单分子层面的研究表明SMC蛋白复合体和Cohesin蛋白的确能够将DNA挤压形成环状。因此，关于基因组的三维结构形成研究者们提出了“环挤出假说"，认为染色体结构维持的SMC复合物组织就基因组的拓扑结构，并通过环挤出来实现这一功能。但是这一过程的具体细节是如何进行的还不得而知。

瞬时受体电位（TRP）通道是一个庞大的真核离子通道超家族，控制着多种生理功能，因此是具吸引力的药物靶点。目前已确定了来自 20 多种不同 TRP 通道的 210 多种结构，且均为四聚体。尽管有如此丰富的结构信息，但关于 TRPV 通道的许多方面仍知之甚少，包括孔道扩张现象，即长时间激活会导致电导增加、对大离子的通透性增强以及整流性丧失。在此，我们利用日本RIBM公司的超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM，SS-NEX）在单分子水平上分析了嵌入膜的 TRPV3，并发现了一种五聚体状态。HS-AFM 动态成像显示，五聚体在与经典四聚体的动态平衡中具有短暂性和可逆性，通过膜扩散亚基交换实现。加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，五聚体的群体增加，DPBA 是一种已被证明可诱导 TRPV3 孔道扩张的激动剂。基于这些发现，我们设计了一条蛋白质生产和数据分析流程，最终获得了 TRPV3 的冷冻电子显微镜结构。五聚体，其孔径比四聚体大。进入和退出五聚体状态的缓慢动力学、加入 DPBA 后五聚体形成的增加以及孔径的扩大表明，五聚体代表了孔径扩张的结构相关性。因此，我们展示了膜扩散原体交换作为结构变化和构象变异性的一种额外机制。总的来说，我们为非典型的五聚体 TRP 通道组装提供了结构证据，为 TRP 通道研究开辟了新的方向。

结果：

（1）：将蛋白质脂质体沉积在新切割的云母上，并在缓冲溶液中成像，通过HS-AFM视频，发现在典型四聚体通道旁边检测到五聚体TRPV3。

（2）：观察到29个明确的TRPV3四聚体-五聚体或五聚体-四聚体转换过程（12 + 11 + 6）,65个只有TRPV3五聚体的状态。作者在320μM二苯基硼酸酐（DPBA）存在的情况（DPBA是一种配体，之前已被证明可以诱导TRPV3中的孔膨胀）下通过HS-AFM对TRPV3进行了成像。

（3）：为了进一步探究 DPBA 对 TRPV3 四聚体状态的破坏作用，我们进行了纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）实验，并通过监测 350 和/或 330 纳米处荧光发射随温度的变化来测量 TRPV3 的热稳定性。在 nanoDSF 实验中，测量的是蛋白质中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的固有荧光，其会因局部环境的变化而改变，例如温度依赖性的构象变化、寡聚体解离和/或变性。TRPV3 的热变性曲线显示出两个一阶导数峰，分别对应两个熔解温度，DI YI个熔解温度（Tm1）表现为反向蓝移曲线，在 55.5 ± 0.1°C 处有一个拐点，第二个熔解温度（Tm2）在 63.4 ± 0.3°C 处有一个拐点（图 4c，d）。值得注意的是，当向同一蛋白质样品中加入 320 μM DPBA 时，Tm1 降至 52.7 ± 0.6°C，Tm2 降至 61.3 ± 0.5°C。而当分别加入 32 和 100 μM DPBA 时，这些配体浓度已被证明可诱导典型的尽管激活了电流但并未增强次级电流 25，熔点更接近于无配体状态，即 Tm1 和 Tm2 分别为 55.1 ± 0.5 和 54.5 ± 0.3 摄氏度以及 63.1 ± 0.3 和 62.6 ± 0.6 摄氏度（图 4c，d）。最后，当向样本中加入 1000 μM 的 DPBA（一种已被证实会导致导电性崩溃的配体）时，观察到稳定性进一步显著下降，Tm1 和 Tm2 分别为 51.3 ± 1.0 和 60.5 ±0.3°（图 4c、d）。在 350 纳米和 330 纳米处的荧光红移表明内部色氨酸暴露，而荧光蓝移则内部色氨酸缺失或在热变性过程中内部酪氨酸的暴露相关。通过检查 TRPV3 结构中酪氨酸和色氨酸的分布，我们发现许多内部隐藏的色氨酸和酪氨酸，特别是许多隐藏在亚基界面处的酪氨酸（补充图 4）。这使我们推测 Tm1 对应于 TRPV3 低聚物的解体，表现为亚基界面处的酪氨酸暴露，而 Tm2 对应于 TRPV3 单体的变性。另一种解释可能是 Tm1 与温度感应构象变化有关，而 Tm2 与单体断裂和变性有关。无论具体事件的顺序如何，DPBA 显然影响了单体界面的完整性并使通道不稳定。因此，这些结果与我们在添加 DPBA 后通过 HS-AFM 观察到的四聚体减少和 TRPV3 片段增加是一致的。

结果：
HS-AFM

将 2 微升的 TRPV3 重组囊泡液滴置于 1.5 平方毫米的新鲜云母表面，该表面用紫外线胶粘在石英样品台上。在湿度室中孵育 5 分钟后，用成像缓冲液（无配体（apo）条件：20 毫摩尔 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩尔 NaCl；孔扩张条件：20 毫摩尔 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩尔 NaCl 和 320 微摩尔 DPBA）轻轻冲洗样品台上的样品，然后将其安装在 HS-AFM 液体池中。在 150 毫摩尔 NaCl 存在的情况下，一个薄薄的缓冲液层（约 5 埃）将支撑膜与云母基底隔开，使膜蛋白能够扩散，如本文中 TRPV3 通道在密集膜中的横向和旋转运动所显示的那样。在室温下使用 HS-AFM（SS-NEX，日本RIBM公司）以振幅调制模式拍摄图像，该模式具有优化的扫描和反馈参数，并使用 IgorPro RIBM 软件（Ibis v.1.1.0，IgorPro v.6.3.7.2）。使用了标称弹簧常数为 0.15 牛顿/米、共振频率约为 650 千赫兹、在缓冲液中的品质因数约为 1.5 的超短（8 微米）悬臂（USC-F1.2-k0.15，NanoWorld）。IgorPro v.8（WaveMetrics）用于高扫描速率原子力显微镜（HS-AFM）数据采集。采用氧等离子体蚀刻来锐化针尖。HS-AFM 图像以每秒 0.5 至 3 帧的速度采集，像素采样率为每像素 1.25 至 8 埃。在非常相似的条件下进行的 HS-AFM 成像已用于分析其他几种膜蛋白的结构和动态，如 OmpG、AqpZ、ec-CLC、GltPh、CorA、Piezo-1 和 GLIC42，51–57，但从未观察到像此处记录的 TRPV3 这样的寡聚化变化。HS-AFM 视频对齐、平整化和横截面分析、高度分布和径向轮廓分析均在 ImageJ 中完成。

NanoDSF

使用 NanoDSF 技术对在 HEK293S GnTI− 细胞中表达的纯化 TRPV3 进行了热变性曲线测量，所用样品为从尺寸排阻色谱柱中获得的对应纯四聚体的峰组分，将其稀释至 3.3 μM 浓度（在 20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM βME 和 0.01%（w/v）GDN 中）。在无配体条件下以及分别加入 32（n = 6 次生物独立实验）、100（n = 6）、320（n = 7）和 1，000 μM（n = 6）DPBA 后进行了测量，使用 Tycho NT.6仪器，按照制造商的说明进行操作。采用单侧不等方差（Welch）t 检验评估统计学意义，结果表明加入 320 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 均显著降低（99%置信水平，P = 0.000038 和 0.00190），而加入 1，000 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 进一步降低（P = 0.015（95%置信水平）和 0.0043（99%置信水平）。

参考文献：

Shifra Lansky, John Michael Betancourt, Jingying Zhang, Yining Jiang, Elizabeth D. Kim

A pentameric TRPV3 channel with a dilated pore

206 | Nature | Vol 621 | 7 September 2023

新品推荐——日本RIBM公司研发的超高速视频原子力显微镜HS-AFM来到中国

为了更好地服务国内客户，北京佰司特科技有限责任公司将这款超高速视频级原子力显微镜引进中国，如果您有科研上的需要，欢迎致电联系我们！

北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的DI YI款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司，郑州大学河南省医药科学研究院，吉林大学，辽宁大学，成都生物研究所，北京工商大学，石河子大学，友谊医院消化健康全国重点实验室，深圳技术大学，深圳先XIAN进技术研究院、清华大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学、中科院武汉病毒所等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano等）。

北京佰司特科技有限责任公司

类器官串联芯片培养系统—HUMIMIC；类器官灌流式培养和代谢监测系统—IMOLA；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子稳定性分析仪（磁镊力谱测量仪）—HiMT；单分子质量光度计—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

微纳加工点印仪—NLP2000/DPN5000；台式原子力显微镜—ACST-AFM；全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；