全自动外泌体荧光检测分析系统

单外泌体表征分析

全自动外泌体荧光检测分析系统—Leprechaun能够针对性的捕获外泌体，检测其粒径大小并结合荧光分析，确认外泌体是否含有所有标志物蛋白，从而获得外泌体的相关颗粒浓度及表型信息。

全自动外泌体荧光检测分析系统—Leprechaun可以测量低至35 nm的囊泡。从外泌体到外泌颗粒，Leprechaun可以让您获得这些小颗粒的粒径大小，颗粒数量和表信息。对于特殊样品，您可以使用自己的检测抗体定制检测方法，或者使用Flex试剂盒定制您用来捕获外泌体的特异性识别抗体。无论您的标记物在内部的还是外部的， Leprechaun只需几微升无需纯化的样品，就可以给您提供多达四种蛋白质的共定位信息。

慢病毒表征分析

在生产过程的每个阶段，都可以对每个慢病毒颗粒进行完整的生物物理鉴定。使用我们的抗体或您的抗体捕获低至1x107颗粒/毫升的病毒样品，根据病毒的粒径大小识别出单个病毒或者团聚体。使用荧光抗体标记病毒衣壳蛋白，使用RNA探针标记病毒核酸，确认病毒的完整性和空实心比。Lepre-chaun可以分析任何慢病毒，无论其结构如何变化。

Leprechaun全自动外泌体荧光检测分析系统是一款无需纯化的、全自动的可对单个外泌体进行表征分析的全新设备。该设备能够提供全面的外泌体表征信息，包括外泌体粒径大小、计数、分布、携带蛋白表达、生物标志物（CD9，CD81，CD63等）共定位等。操作简单，结果可靠。一经推出，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，短短两年时间在全球已有50多个实验室采用该技术，发表重要文献近百篇。

Leprechaun全自动外泌体荧光检测分析系统基本原理是一种基于特异性免疫捕获技术，允许研究者直接分析特定群体的外泌体或外囊泡。通过配套的试剂盒，客户一次性能够分析多达9个不同的样本，大大节省了时间和经济成本。兼容各种生物样本，除了纯化的外泌体之外，对于血液、尿液、恶性肿瘤、腹水中的外泌体也可直接检测分析，大大拓展了研究范围。

Unchained收购外泌体公司NanoView

2022 年 5 月6日，Unchained Labs （Unchained）是一家致力于为生物制剂和基因治疗研究人员提供合适工具的生命科学公司，该公司当日宣布收购了外泌体公司NanoView Biosciences（NanoView）。NanoView 的 ExoView 技术在表征外泌体方面处于地位，他们最近推出的 LentiView 平台是研究慢病毒的基因治疗研究人员的游戏规则改变者。

外泌体是细胞释放的信使粒子。它们是有关疾病的已知信息来源，但也是基因治疗有效载荷的高潜力载体。ExoView 使用抗体芯片通过其表面蛋白捕获外泌体，使用高分辨率干涉仪确认其大小，并识别多达 5 种具有 4 色荧光的额外表面蛋白。研究人员可以寻找感兴趣的外泌体，或者获得他们正在开发的基因疗法的真实滴度——即使是在粗糙、杂乱的样本中也是如此。慢病毒在修改基因组方面非常出色，这就是为什么基因治疗开发如此之多的原因。问题是它们巨大、难以制造且高度复杂——由脂质、蛋白质和带有有效载荷的衣壳组成。如今，对慢病毒进行表征非常具有挑战性，需要研究人员进行纯化，然后使用 ELISA 或 PCR 等破坏性分析来找出难题的一部分。

LentiView 改变了游戏规则，让研究人员可以直接看到原始样品中的每个成分。LentiView 结合了微芯片上的抗体捕获、荧光和干涉测量技术，可以准确地告诉研究人员他们想知道的关于慢病毒的信息——有多少、大、纯、满或空，以及是否有靶向蛋白质。

“NanoView 一直致力于帮助外泌体研究人员表征这些复杂的颗粒，"NanoView Biosciences 执行官 Jerry Williamson 说。“我们刚刚开始进行病毒载体表征，没有比 Unchained Labs 更好的公司来帮助我们将 LentiView 交到基因治疗研究人员手中。"

Unchained Labs 的创始人兼执行官 Tim Harkness 说：“基因疗法的发展正在爆炸式增长，研究人员迫切需要更好的工具。" “我们的使命是为他们提供更好的方法来表征这些的复杂载体，我很高兴将 NanoView 的基因治疗解决方案添加到我们的产品组合中，并让他们的团队加入我们的事业。"

Unchained Labs公司所开发的全自动外泌体荧光检测分析系统是一款无需纯化的、全自动的可对单个外泌体进行表征分析的全新设备。该设备能够提供全面的外泌体表征信息，包括外泌体粒径大小、计数、分布、携带蛋白表达、生物标志物（CD9，CD81，CD63等）共定位等。

应用方向及主要特征

外泌体粒径分析

能够对>50 nm的外泌体进行全方面的表征，无论是粒径尺寸、粒径分布还是外泌体的亚型均可在一次测试中得到。并且所用来测试的样本无需进行纯化，避免因纯化带来的样本偏差。

分析不同大小和不同尺度的外泌体亚群，在CD171过表达系统中，100 nm以上的外泌体仅表达了CD171。

量化外泌体亚群

通过抗体捕获的模式，能够量化含有不同标记物的外泌体亚群，并对不同种群的外泌体进行特异性计数和分析。整个过程无需纯化，并且线性范围可跨越3个数量级。

TSPAN8阳性细胞外囊泡的稀释曲线。使用1:3比例的梯度稀释。用R2 = 0.9986计算与TSPAN8荧光数据的线性拟合。

检测外囊泡中的装载物

MISEV建议在表征外泌体和外囊泡时，应当同时测量表面和载体蛋白。使用ExoView芯片可穿透外泌体，探测膜内蛋白和载体。并且单次可定量3种表面、管腔蛋白。

检测细胞外泌体内的Syntenin

WT细胞在未穿膜的条件下几乎观测不到Syntenin的信号。进行穿膜处理后可以观测到Syntenin信号，而KO之后信号消失

生物标志物共定位

能够在单个外泌体样本上检测多达4种标记物，并同时提供外泌体的其它表征数据诸如计数、颗粒尺寸统计等。

无需纯化

只测量含有靶标抗原的特定细胞外泌体群体。仅需35 μL的稀释样品，即可直接获得外泌体的表型、粒径和计数信息。并且无需担心污染物对测试的影响。

无论纯化与否，Exoview均可进行分析

ExoView™ Kit 配置清单:

应用案例：

对不同体液中小RNA测序以筛选最佳的胞外RNA提取方法

exRNA profile会受到不同来源（细胞/组织），不同状态（年龄/健康程度/器官状态）的影响，且由包括外泌体在内的不同的载体运输，加上不同的提取方法和检测技术，均会影响exRNA profile的测定结果。现今的小RNA测序方法已经可以准确地表征exRNA profile，因此合适的exRNA提取方法便至关重要。Srinivasan[1]等通过使用多种exRNA分离方法分离不同位点获得的5种体液中的外泌体，分析结果后总结出了不同体液的适合分离方法。

其中，研究人员使用单个外泌体表型分析技术检测了来源于人血浆的外泌体的蛋白marker表达，判断出血浆外泌体根据蛋白marker主要分为CD63-/CD81+/CD9+和CD63+/CD81+/CD9+两种。

人血浆外泌体蛋白表达分析

参考文献：Srinivasan, S., Yeri, A., Cheah, P. S., Chung, A., Danielson, K., De Hoff, P., ... & Laurent, L. C. (2019). Small RNA sequencing across diverse biofluids identifies optimal methods for exRNA isolation. Cell, 177(2), 446-462.

脊髓损伤导致血清神经炎症相关纳米颗粒中miRNA与CD81+外泌体水平的改变

脊髓损伤（SCI）会对机体产生系统性影响，导致呼吸、免疫、消化等功能异常，以及相关脑区产生神经炎症和退行性病变。有研究表明，SCI的病理与系统性影响可能与血液来源的因子如外泌体的运输有关；而在中枢神经系统损伤模型中，外泌体可能参与了miRNA等炎性因子运输导致炎症扩散。Khan等使用外泌体表型分析的多种技术详细表征了SCI建模的小鼠血浆外泌体，发现损伤后外泌体数量、蛋白marker和内容物均有明显的变化，将SCI小鼠的外泌体注射入脑室还可诱发产生炎症。

研究人员测了SCI血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位（图1A）。外泌体在CD81和CD9区域产生特异性结合而被捕获，而没有CD63捕获。根据干涉成像获得外泌体尺寸分布，其中在50nm最多（图1B&C）。荧光成像则检测到了大量干涉成像检测不出的尺寸小于50nm的外泌体（图1D&E），CD81和CD9在大量外泌体上表型出荧光共定位，而CD63荧光则未被检测到，这与图1C结果一致（图1F-H）。相比之下，NTA与流式分析无法检测到尺寸小于50nm的外泌体。

图1检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

研究人员进一步比较了SCI组和对照组的血浆外泌体变化，结果表明，在损伤后1d的时间点，CD81外泌体数量相对对照组更高，与Western Blot的结果一致；而CD9外泌体数量则没有统计学差异，与流式分析的结果一致（图2A&B）。基于图2H的CD81与CD9有大量的荧光共定位，检测CD9外泌体的CD81荧光强度，由1d的荧光强度中位数差异可知，

图2检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

参考文献： Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2020). Spinal cord injury alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and immunity.

Cells：CD44糖蛋白在胃癌发生中的作用
CD44是一种跨膜糖蛋白，能够介导细胞间与细胞-基质间相互作用，主要配体为透明质酸（HA）。研究表明，CD44与肿瘤的生长相关，其在肿瘤细胞中高表达，且CD44与HA的结合亲和力高，因此纳米载体常用HA做表面修饰以作为肿瘤细胞的靶向药物载体。外泌体是天然的靶向信息传递载体，有研究在外泌体中检测到CD44。Härkönen等[1]使用胃癌细胞MKN74研究了CD44表达对外泌体分泌，HA合成与肿瘤细胞生长的影响。结果表明，CD44促进了细胞表面和细胞间的HA形成，调控肿瘤微环境；CD44可改变外泌体的物理性质以及靶向性质。

其中，研究人员使用Exoview检测了MKN74细胞的未经纯化的培养基及分离纯化后的外泌体中的含CD44以及其他标记物的含量。结果表明，相对于对照组，MOCK（CD44敲除）细胞组在未经纯化的培养基及分离纯化后的分泌外泌体的数量显著降低。以上结果表示ExoView可以直接对复杂环境的培养基进行检测，无需分离纯化步骤，且检测结果具有*特异性。

检测表达不同蛋白标记物的外泌体数量

参考文献： Härkönen, K., Oikari, S., Kyykallio, H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

Cancer Cell Int：外泌体与miRNA调节成神经管细胞瘤的干细胞性

脑瘤中部分细胞具有干细胞特性，能够自我更新并分化为不同细胞系。其中，成神经管细胞瘤的病人有25%经过传统疗法后5年内复发并转移导致死亡，存活的病人也受到治疗副作用和并发症影响，因此需要一种安全有效的治疗方法。肿瘤细胞的外泌体含有miRNA，能够调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生理过程并与抗药性相关。有研究表明肿瘤干细胞的外泌体运载了肿瘤细胞*的miRNA，能够产生有利于肿瘤发展的微环境。Choi等研究了成神经管细胞瘤的外泌体及运载的miRNA及其在肿瘤康复中的潜在作用。其中，miR-135b和miR-135a在肿瘤干细胞中高表达，抑制两者会导致具有肿瘤抑制作用的Angiomotin‑like 2（AMOTL2）表达上升，使肿瘤干细胞的干细胞特性下降。

其中，研究人员通过荧光成像检测肿瘤细胞与肿瘤干细胞的外泌体标记物，在两种细胞的外泌体上均检测到了Alix和Syntenin两种内蛋白，并且可以确定两种内蛋白与CD63/CD9外泌体标记物共定位。

检测外泌体上的Alix（a）与Syntenin（b）蛋白

参考文献： Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J. H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

外泌体计数、粒径、蛋白表达、蛋白共定位一次完成

北京佰司特科技有限责任公司

类器官串联芯片培养系统—HUMIMIC；类器官灌流式培养和代谢监测系统—IMOLA；

蛋白稳定性分析仪—PSA-16；单分子稳定性分析仪（磁镊力谱测量仪）—HiMT；单分子质量光度计—TwoMP；超高速视频级原子力显微镜—HS-AFM；微流控扩散测量仪—Fluidity One-M；

微纳加工点印仪—NLP2000/DPN5000；台式原子力显微镜—ACST-AFM；全自动半导体式细胞计数仪—SOL COUNT；农药残留定量检测仪—BST-100；